normalization_methods

# deepTools 归一化方法 本文档解释了 deepTools 中可用的各种归一化方法以及每种方法的使用时机。 ## 为什么要归一化？ 归一化对于以下情况至关重要： 1. **比较具有不同测序深度的样本** 2. **考虑文库大小的差异** 3. **使覆盖度值在不同实验间具有可解释性** 4. **实现不同条件下的公平比较** 如果不进行归一化，即使真实的生物学信号完全相同，拥有 1 亿条读取（reads）的样本看起来也会比拥有 5000 万条读取的样本具有更高的覆盖度。 --- ## 可用的归一化方法 ### 1. RPKM (每百万映射读取中每千碱基的读取数) **公式：** `(读取数) / (区域长度(kb) × 总映射读取数(百万))` **使用时机：** - 比较同一样本内的不同基因组区域 - 同时针对测序深度和区域长度进行调整 - RNA-seq 基因表达分析 **可用工具：** `bamCoverage` **示例：** bash bamCoverage --bam input.bam --outFileName output.bw --normalizeUsing RPKM **解释：** RPKM 为 10 表示每百万映射读取中，该特征每千碱基有 10 条读取。 **优点：** - 同时考虑了区域长度和文库大小 - 在基因组学中被广泛使用和理解 **缺点：** - 如果总 RNA 含量不同，不适合在样本间进行比较 - 在比较组成差异很大的样本时可能会产生误导 --- ### 2. CPM (每百万映射读取的计数) **公式：** `(读取数) / (总映射读取数(百万))` **别名：** RPM (每百万读取数) **使用时机：** - 在不同样本间比较相同的基因组区域 - 当区域长度恒定或不相关时 - ChIP-seq、ATAC-seq、DNase-seq 分析 **可用工具：** `bamCoverage`, `bamCompare` **示例：** bash bamCoverage --bam input.bam --outFileName output.bw --normalizeUsing CPM **解释：** CPM 为 5 表示在该分箱（bin）中，每百万映射读取有 5 条读取。 **优点：** - 简单直观 - 适合比较具有不同测序深度的样本 - 在比较固定大小的分箱时非常合适 **缺点：** - 未考虑区域长度 - 受高丰度区域影响（例如 RNA-seq 中的 rRNA） --- ### 3. BPM (每百万映射读取的分箱数) **公式：** `(分箱中的读取数) / (所有分箱中的读取总数(百万))` **与 CPM 的主要区别：** 仅考虑落入分析分箱内的读取，而不考虑所有映射